Opravy poškozené DNA

Naše DNA je neustále vystavována nepříznivým vlivům, které způsobují její poškození. Pokud je opravena chybně, mohou vznikat nežádoucí mutace. Buňka proto disponuje velmi účinným opravným aparátem.

Už jsem tady také. Na žádost paní Tenzler jsem se rozhodl rozvést téma oprav poškozené DNA. Již delší dobu plánuji, že začnu přispívat do rubriky Věda, ať tady s podobnými tématy nestraší jenom pan Kunc. Postupně bych tedy rád popsal fungování buňky a kromě toho se také věnoval své oblíbené evoluci.

Pro pochopení oprav DNA považuji vhodné zopakovat některá důležitá fakta. Teď jenom stručně, později je nejspíše rozvedu do samostatných článků.

- molekula DNA je ve skutečnosti dvojšroubovice, v níž je kromě jiného kódováno pořadí aminokyselin v proteinech; ty tvoří hlavní funkční jednotky buněk

- dvojšroubovice DNA je tvořena dvěma samostatnými vlákny, která jsou vzájemně propojena tzv. vodíkovými vazbami

- každé vlákno DNA je řetězcem jednotlivých stavebních kamenů, tzv. nukleotidů

- každý nukleotid je tvořen trojicí cukr-fosfát-dusíkatá báze, přičemž cukr (deoxyribóza) a fosfát (zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné) tvoří kostru DNA a přivěšená dusíkatá báze určuje identitu nukleotidu

- dusíkaté báze vytvářejí vodíkové vazby s bázemi druhého řetězce; takto vždy asociuje adenin s thyminem a guanin s cytozinem, čehož je využito při replikaci DNA, kdy se dvojvlákno rozdělí na dvě samostatná vlákna a podle každého z nich je vytvořeno to druhé do dvojšroubovice (tzv. komplementární řetězec)

- DNA eukaryontních organismů (mezi něž patříme i my, protože máme buněčné jádro i organely, na rozdíl od baktérií) je poskládána do samostatných útvarů zvaných chromozómy

Molekula DNA je ovšem velmi zranitelná, neboť jádro každé naší buňky obsahuje dvojšroubovici o souhrnné délce přes 1 metr a tloušťce pouhých několika nanometrů. Toto dvojvlákno se může různě narušit, dokonce i přetrhnout, anebo být chemicky modifikováno. Zdrojem poškození může být jak ionizující i neionizující záření, o němž píše paní Tenzler ve svých článcích o radioaktivitě, tak i chemické látky pocházející nejen z vnějšího prostředí (škodlivé chemikálie), nýbrž i z běžného buněčného provozu.

Reakce na poškození DNA je jednou z forem tzv. stresových reakcí, při nichž buňky aktivují svůj opravný aparát. Během opravy je zastaven buněčný cyklus, aby se poškozená buňka nemohla rozdělit, a jestliže proces vázne a stresová signalizace přetrvává, normální, slušně se chovající buňka je naprogramována, aby se raději sama zahubila pomocí tzv. regulované buněčné smrti. To má svůj význam, neboť pokud se buňka rozdělí, její opravný aparát již není schopen rozpoznat stav před poškozením, a poškození se tak fixuje (např. v podobě mutací). Výsledkem mohou být nejrůznější nežádoucí projevy včetně nekontrolovatelného buněčného dělení způsobeného zejména poškozením genů, které dělení omezují, a trvalou aktivací genů, které dělení podporují.

Samotný proces reakce na buněčný stres má tři základní fáze, které lze obecně popsat i u dalších pochodů. Nejprve buněčný aparát poškození rozpozná a vyšle příslušné signály. V další fázi je signál znásoben a větví se do různých signálních drah, což má za následek ovlivnění širokého spektra buněčných pochodů (mj. i zastavení buněčného cyklu), a nakonec je poškození buď opraveno, anebo se buňka sama zabije. Buňka používá různé typy oprav podle toho, k jakému poškození došlo. Někdy se ovšem jich uplatní více druhů, jelikož některá lehčí poškození mohou postupně vést až k vážnějším stavům, např. i dvojřetězcovým zlomům v DNA (při nichž je dvojvlákno přetrženo). Při opravách je často využívána komplementarita bazí, díky níž lze podle předlohy syntetizovat druhé vlákno. Někteří evoluční biologové proto soudí, že uložení genetické informace v podobě dvojvlákna DNA vzniklo proto, aby bylo možné provádět opravy s minimálním množstvím chyb. Níže si u jednotlivých druhů poškození DNA popíšeme, jak to buňka dělá.

1) Opravná aktivita DNA-polymerázy. Dvojšroubovice DNA může někdy obsahovat dvojici nukleotidů, jejichž báze navzájem nejsou komplementární, tj.  dvojice adenin - cytozin či guanin - thymin. To může být způsobeno chybami enzymu DNA-polymerázy během replikace, anebo různými chemickými modifikacemi. Chyba musí být neprodleně opravena, protože jinak by se hned při příštím buněčném dělení fixovala mutace spočívající v záměně nukleotidu. Většinu chyb odstraní již během replikace satmotný enzym DNA-polymeráza, který replikaci provádí. Tento enzym je schopný rozlišit zařazení chybného nukleotidu a pozná také, které vlákno je původní a které nově syntetizované. Ostatní chyby mohou být opraveny pomocí procesu zvaného oprava vystřižením báze (viz dále).

2) Oprava vystřižením báze (base excision repair, BER). Jak bylo napsáno výše, tento typ opravy se uplatní, pokud se vyskytne nekomplementární dvojice bází a není opravena DNA-polymerázou během replikace. Vlákno DNA může být ovlivněno také chemickými modifikacemi působením různých toxických látek (např. formaldehydu, apod.) či reaktivních druhů kyslíku. Takto změněné báze mohou zaujímat chybné prostorové uspořádání a vypadat jako jiné, než ve skutečnosti jsou. Nebo se mohou přímo změnit v jiné báze. Např. oxidační deaminací cytozinu vzniká uracil, který je pro buněčný aparát dobře rozpoznatelný, protože uracil se v DNA nevyskytuje, pouze v RNA. Cytozin ovšem bývá v buňce často metylovaný (metylace slouží k utlumení genové exprese). Oxidační deaminací metylcytozinu vzniká metyluracil neboli thymin, a to už je problém, protože z pohledu buněčného aparátu žádná báze není poškozena, a je proto třeba rozhodnout, zda bude odstraněn thymin (správně), anebo guanin z druhého řetězce (špatně, čímž vznikne mutace). A jak BER funguje? Nejprve je odstraněna samotná poškozená báze, poté i deoxyribózová kostra a nakonec je vložen celý správný nukleotid na základě komplementarity s druhým vláknem.

3) Oprava vystřižením nukleotidů (nucleotide excision repair, NER). NER je proces příbuzný BER, který je využíván u rozsáhlejších poškození DNA. Např. působením ultrafialového záření mohou vznikat nové kovalentní chemické vazby mezi bázemi sousedícími ve vlákně DNA (tzv. pyrimidinové dimery). Takto pozměněné báze už nepárují se svými partnery v druhém vlákně, což by mohlo způsobit chyby během replikace, a navíc do vlákna vnášejí nepřirozené pnutí, jehož následkem se může vlákno DNA přetrhnout (tím vznikne jedno-. či dvojřetězcový zlom, viz dále). Poškozené nukleotidy tedy musejí být celé vystřiženy a mimo to jsou odstraněny i nukleotidy okolní. Následně je podle druhého vlákna DNA chybějící řetězec dosyntetizován.

4) Oprava jednořetězcových zlomů. Dvojvlákno DNA se kromě chemických modifikací může také přetrhnout (buď působením nepřirozeného pnutí, nebo ionizujícího záření či toxických chemikálií, např. cytostatik). Pokud to postihne pouze jeden řetězec, hovoříme o jednořetězcovém zlomu, pokud oba, jedná se o dvojřetězcový zlom. Jednořetězcové zlomy nejsou tak nebezpečné, ale pokud v nejsou opraveny, může se nakonec přetrhnout i druhé vlákno a vzniknout zlom dvojřetězcový. Vadí to také během replikace, kdy je dvojšroubovice rozplétána a vlákna od sebe oddělena. Oprava je ovšem jednoduchá. Chybějící chemickou vazbu mezi sousedními nukleotidy opraví enzym ligáza.

5) Opravy dvojřetězcových zlomů. Tento druh poškození DNA je nejzávažnější, protože při opravách může vznikat nejvíce chyb. Pokud se takovýchto zlomů vyskytne více, mohou být pospojovány chybné volné konce, a tím vyměněny celé úseky chromozómů. Takto mohou vznikat chimérické geny produkující proteiny s novými vlastnostmi, případně se promotor velmi aktivního genu může dostat do sousedství genu, který podporuje buněčné dělení. Takovýto gen je poté trvale aktivován a mění se na onkogen. Buňky jsou proto naprogramovány, aby v případě, že se dvojřetězcových zlomů vyskytne větší množství, raději podstoupily regulovanou buněčnou smrt. Nejvíce náchylné k této formě smrti jsou rychle se dělící buňky různých epitelů, u nichž jsou aktivovány geny podporující buněčné dělení a často probíhá replikace DNA. Jakákoli chyba tedy může mít fatální následky. Tohoto faktu je ovšem využíváno při léčbě rakoviny. Rakovinné buňky se také dělí velmi rychle, takže pokud se v nich ozařováním či působením cytostatik indukuje vznik dvojřetězcových zlomů, tyto buňky rychle hynou. Vedlejším účinkem však je, že hynou také ostatní rychle se dělící buňky, takže má poté pacient trávicí potíže a vypadají mu vlasy.

Buňka při opravách dvojřetězcových zlomů využívá dvou základních mechanismů. To, který se uplatní, závisí na fázi buněčného cyklu, zejména na tom, zda již proběhla replikace DNA.

Oprava nehomologním spojováním konců DNA (non-homologous end-joining, NHEJ). Tento druh oprav dvojřetězcových zlomů se využívá v počátečních fázích buněčného cyklu (když ještě neproběhla replikace DNA). Je nejvíce náchylný k chybám. Jeho nejjednodušší variantou je, že se volné konce DNA přivedou do těsné blízkosti a poté se jednoduše znovu propojí. Pokud je v buňce zlomů v DNA málo, nemusí to vést k ničemu závažnému, ale jak už bylo popsáno výše, mohou být spojeny nesprávné konce, následkem čehož jsou poté vyměněny (translokovány) rozsáhlé úseky chromozómů. Volný konec DNA je navíc náchylný k dalšímu poškození. Mohou se od něj odštěpovat nukleotidy, takže když jsou potom oba volné konce spojeny, několik nukleotidů může chybět. Tím vznikne tzv. delece, a pokud to postihne kódující oblast genu, může ho to buď vyřadit z činnosti, anebo způsobit, že je produkován pozměněný protein (např. mu chybějí některé části, které jsou důležité pro jeho regulaci). Takto se z dobře regulovaného genu podporujícího buněčné dělení může stát onkogen. Krom toho existuje typ NHEJ zvaný MMEJ (microhomology-mediated end-joining). Při něm jsou volné konce DNA před spojením cíleně opracovány a následně vždycky vznikají delece dlouhé až desítky nukleotidů.

Oprava homologní rekombinací (homology-directed repair, HDR, nebo homologous recombination, HR). Pokud již proběhla replikace DNA, může buňka využít druhého typu oprav dvojřetězcových zlomů. Jako předloha je k opravě použita nepoškozená sesterská chromatida (tj. replikované dvojvlákno DNA). Buněčný aparát po rozpoznání zlomu hledá v sesterském dvojvlákně homologní (shodný) úsek a následně podle něj opraví poškozené místo (vlastně ho do poškozeného místa zkopíruje). Proces je to poměrně složitý a účastní se ho velké množství regulačních proteinů. Mezi ně patří např. protein BRCA1, který bývá poškozen u dědičných forem rakoviny prsu (má ho poškozen např. Angelina Jolie). HDR je v takovémto případě silně narušena a více se uplatňuje NHEJ. Následkem toho vznikají chyby a některé tkáně jsou silně náchylné k rozvoji rakovinného bujení. Ani HDR není ovšem zcela bezchybná. Někdy se totiž buněčný aparát "splete" a namísto sesterské chromatidy použije k opravě homologní úsek z chromozómu pocházejícího od druhého rodiče. V takovémto případě může dojít v příslušném genu k tzv. ztrátě heterozygotnosti. Buňka má najednou u daného genu dvě stejné alely, což většinou nevadí, ale problém nastane, pokud je alela od jednoho rodiče funkční a druhá alela nikoli. Po genové konverzi mohou být buňce přítomny již dvě nefunkční alely a žádná funkční, a pokud se to týká např. genu regulujícího buněčný cyklus, nastává vážný problém. Např. u dědičného retinoblastomu (rakovina sítnice) má člověk přítomnu jednu chybnou alelu genu kódujícího protein pRB (retinoblastomový protein), regulujícího vstup do fáze buněčného cyklu, při níž dochází k replikaci DNA. Po genové konverzi je pRB nefunkční, a buňka se tak může začít nekontrolovatelně dělit.

Genomové editace. Dvojřetězcových zlomů v DNA může být využito také v genetickém inženýrství. Nové metody, např. CRISPR / Cas9, umožňují relativně snadno cíleně pozměňovat (editovat) vybrané geny. Společnou podstatou těchto metod je vytvoření dvojřetězcového zlomu v přesně stanoveném místě v DNA a následné využití chyb při jeho opravě. Nebudu zabíhat do zbytečných detailů. NHEJ se zkrátka hodí, pokud chceme nějaký gen vyřadit z činnosti (připravit tak cílenou genovou deleci neboli "knock-out"). Naopak pokud gen nechceme zničit, nýbrž pouze změnit, lze využít HDR a genové konverze. Při ní je v DNA opět navozen dvojřetězcový zlom a zároveň je do buňky vneseno vlákno DNA, které je homologní k poškozenému úseku. Homologie ovšem není stoprocentní, je zde také přítomno to, co chceme do DNA vložit (záměna nukleotidů, přivěšení další části proteinů, apod.). Následkem genové konverze je poté příslušný gen trvale pozměněn.

6) Další druhy oprav DNA. Existují ještě další typy poškození DNA, která jsou opravována složitými a ještě ne zcela dobře pochopenými mechanismy. Jedním z nich je např. kovalentní propojení obou vláken DNA k sobě. V takovémto případě už není vlákna možné při replikaci oddělit, a pokud to není opraveno, vznikají dvojřetězcové zlomy. Oprava je v tomto případě velmi náročná a značně náchylná k chybám.

Z výše popsaných poškození DNA a způsobu jejich oprav by mohl vzniknout dojem, že buňky jsou chudinky, jejichž genom vlivem chyb neodvratně degraduje. Ve skutečnosti jsou ovšem opravy vysoce účinné a chyby jsou spíše vzácné. Buňka musí opravovat stovky poškození denně, ale většinou se to nikterak neprojeví. Vyskytnou-li se ovšem chyby, může to mít fatální následky. Buňka má nicméně k dispozici další pojistky, které brání nekontrolovatelnému dělení. Tyto pojistky popíšu někdy příště.