Tvorba antigenně specifického receptoru - důkaz evoluce na molekulární úrovni

Na příkladu formování antigenně specifického receptoru lymfocytů si popíšeme molekulární důkaz evoluce. Tento proces zahrnuje naprodukci potomstva, jeho variabilitu, dědičnost této variability i selekci. Přesně podle Darwina.

Náboženští blouznivci, kteří popírají evoluci, velmi často opakují, že pro ni neexistuje žádný důkaz. Sázejí přitom na to, že je evoluce velice pomalý proces, jenom obtížně postřehnutelný během relativně krátkého lidského života. Mohou tedy vítězoslavně říkat: Vidíte, nemáte žádné pozorování. Kdepak nějaké fosilie. Ty přece nejsou žádným důkazem evoluce, nýbrž pozůstatkem Potopy světa. Však vám chybějí mezičlánky…

Jenže v tom se pletou (proto jsou to blouznivci). Věda se dost rychle vyvíjí a jejich přírodovědný rozhled, pokud vůbec nějaký mají, uvázl velmi hluboko v minulosti. Dnes již máme příklady vzniku nových druhů v historicky velice krátké době. Ale těm se nyní věnovat nechci, jelikož tito blouznivci beztak netuší, co je to druh, takže je dosti pravděpodobné, že mi velice brzy v diskuzi někdo napíše nějakou nelogičnost. Třeba to, že ještě nikdo nepozoroval, že by se z tuleně stal závodní kůň, což svědčí o tom, že evoluce neexistuje.

V tomto článku bych se proto chtěl věnovat jednomu z molekulárních důkazů evoluce, jelikož ty jsou mnohem pádnější. Techničtěji zaměření náboženští blouznivci totiž mají snahu vypočítávat pomocí jednoduché kombinatoriky, že je zhola nemožné, aby prostým hromaděním mutací vznikaly nové vlastnosti proteinů. Říkají, že i kdyby nějaká selekce existovala, byla by pravděpodobnost takovýchto novátorských mutací natolik malá, že by překročila věk vesmíru. Jejich výpočty jsou vskutku úctyhodné, zejména ta jejich olbřímí čísla. To přece musí přesvědčit i „věřícího evolucionistu“ (sic!).

Takovéto výpočty ovšem nemají žádnou váhu, odporují-li pozorované skutečnosti. Pokud nějaký vědec vytvoří matematický model, který je v rozporu s tím, co pozoruje on či jeho kolegové, znamená to, že je chyba ve výpočtu, a je tedy třeba ho přizpůsobit. Kdepak však náboženský blouznivec. Ten raději fakta ignoruje. Je-li třeba upozorněn na to, že všechny aminokyseliny v proteinu nejsou rovnocenné, bere to jako výmluvu, jelikož neví, že aminokyseliny skutečně rovnocenné nejsou.

Pro lepší pochopení příkladu, který se chystám uvést, si nejprve zopakujme teorii – a to teorii, okolo které se diskuze se zdejšími náboženskými tmáři nejčastěji točí. Zopakujeme si tedy hlavní principy Darwinovy evoluční teorie (aktualizované o moderní poznatky, nicméně ty principy jsou stále považovány za klíčové).

Vznik účelných vlastností v přírodním výběru je podle Darwinovy evoluční teorie založen na čtyřech základních předpokladech:

• nadprodukce potomstva
• variabilita potomstva (nově též víme, že je variabilita neustále doplňována mutacemi, takže pokud nějaká alela z populace zmizí, mezitím vzniknou zase jiné, a dostatečně velká populace tedy zůstává geneticky rozmanitá)
• dědičnost variability
• výběr

V kostce to znamená, že je v každé generaci produkováno větší množství potomků, než kolik jich nakonec úspěšně předá svou genetickou informaci dále (může se jednat o relativní úspěšnost, kdy nositelé jedné alely postupně výrazně početně převýší nositele alely jiné). Výběr určí, které dědičné vlastnosti jsou výhodné a které svého nositele znevýhodňují. Ty nevýhodné budou v populaci ubývat, až vymizí úplně či zůstanou velice vzácné, zatímco ty výhodné převládnou.

Náboženští blouznivci by to nejraději prohlásili za pohádku, které je potřeba věřit opravdu silně, abychom to mohli považovat za skutečnost. Co když ale máme přímo ve svých vlastních tělech proces, který probíhá každodenně a je vynikající ukázkou evoluce na molekulární úrovni?

Tím procesem je vznik antigenně specifického receptoru u lymfocytů. Formování tohoto receptoru je zcela klíčové pro adaptivní imunitní systém živočichů (existuje i adaptivní imunitní systém baktérií, ale např. o systému CRISPR/Cas9 napíši někdy jindy). Více jsem se adaptivnímu imunitnímu systému věnoval ve svém dřívějším článku. Zmínil jsem zde mimo jiné i to, že proces formování antigenně specifického receptoru nepotěší kreacionisty, neboť je důkazem evoluce na molekulární úrovni. Byl to však krátký odstavec uprostřed dlouhého článku, který mohl snadno zapadnout. Nyní jej tedy rozvedu více.

Pro začátek několik pojmů. Antigenem rozumíme v imunologii jakoukoli cizorodou strukturu (nejčastěji protein či peptid), proti němuž imunitní systém tvoří protilátky. Adaptivní imunitní systém obratlovců se vyznačuje schopností přizpůsobit se prakticky libovolnému antigenu, s nímž se setká (nejlépe je vyvinut u ptáků a savců). K tomu jsou důležité antigenně specifické receptory, speciální buněčné receptory na povrchu T- a B-lymfocytů. Protilátky jsou pak rozpustné formy antigenně specifických receptorů B-lymfocytů.

Antigenně specifické receptory jsou proteinové komplexy, jejichž některé podjednotky (tj. samostatné proteiny) se podílejí na struktuře vazebného místa pro antigen, zatímco jiné zprostředkovávají přenos signálu do nitra buňky. U B-lymfocytárního antigenně specifického receptoru (na nějž se zaměřím více) zodpovídají za vazbu antigenu lehké a těžké řetězce. Lidé mají ve svém genomu vždy pár alel pro příslušný proteinový řetězec (jednu kopii od matky, druhou od otce). Exprese jedné z alel však bývá epigeneticky umlčena, takže každý jednotlivý T- i B-lymfocyt má vždy aktivní pouze jeden příslušný gen a na svém povrchu nese molekuly jenom jednoho konkrétního antigenně specifického receptoru.

A jak adaptivní imunitní systém dosáhne přizpůsobení téměř libovolnému antigenu? Využívá k tomu přestaveb v těch místech genomu, která u antigenně specifického receptoru zodpovídají za vazbu antigenu. Tyto přestavby probíhají u T- i B-lymfocytů během jejich zrání a u B-lymfocytů pokračují i později, při imunitní reakci. V důsledku toho vzniká u každého lymfocytárního klonu (buněčná populace odvozená z jediné buňky) zcela unikátní receptor. Principem těchto přestaveb je řízené vyvolání poškození DNA a jeho chybná oprava, což vede ke vzniku náhodných mutací. Ty jsou poté v selekci testovány a vybírány jsou takové, které umožní vazbu antigenu. Podobně funguje i přírodní výběr.

Náš imunitní systém využívá i značnou nadprodukci potomstva. V  kostní dřeni vznikají denně miliardy nezralých lymfocytů, které dále diferencují v T- a B-lymfocyty a v jejich jednotlivé podtypy a také v NK-buňky (natural killers, „přirození zabíječi“, zvláštní typ lymfocytů, který zabíjí některé „podezřelé buňky“, tj. některé buňky potencionálně rakovinné či napadené viry). U T- a B-lymfocytů poté, v počátečních fázích jejich zrání, proběhne genomová přestavba oblastí kódujících ty části receptoru, které jsou zodpovědné za vazbu antigenu. U B-lymfocytů se to nazývá V-D-J rekombinace (v případě těžkých řetězců), resp. V-J rekombinace (u lehkých řetězců). U T-lymfocytů se to nazývá trochu jinak, ale princip přestaveb je stejný.

Obrázek níže znázorňuje V-D-J rekombinaci (u V-J rekombinace chybějí segmenty D).

Před rekombinací se v příslušném místě nachází větší množství různých segmentů V, D i J (u těžkého řetězce B-buněčného receptoru je 44 segmentů V, 27 segmentů D a 6 segmentů J, pro zjednodušení jsou znázorněny vždy pouze čtyři). V prvním kroku je štěpena libovolná genomová spojka mezi sousedními segmenty D (je vybrána náhodně) a libovolná spojka mezi segmenty J. V průběhu následné opravy DNA, které se účastní stejné pochody jako při opravách náhodných dvojřetězcových zlomů, je vše, co se nacházelo mezi oběma místy štěpení, odstraněno, zatímco zbytek se znovu propojí (část obrázku pod první šipkou). V dalším kroku je štěpena libovolná spojka mezi segmenty V a znovu libovolná spojka mezi zbylými segmenty D. Vše, co je mezi místy štěpení, je opět odstraněno, a tak se k sobě dostanou segmenty V, D a J (znázorněno tečkováním u části obrázku nad poslední šipkou). To, které to konkrétně budou, je věcí náhody. Výsledný protein obsahuje ještě segment C (nyní se o něm více rozepisovat nebudu; do blízkostí segmentů V, D a J se dostává v důsledku sestřihu mRNA po transkripci).

Zde by mohl skeptik podotknout následující: ano, takže máme limitovaný počet jednotlivých typů segmentů, ty se náhodně poskládají a vznikne vazebné místo. Kombinatoricky to však moc možností neposkytuje a je zvláštní, jak by mohly vznikat struktury vázající libovolný antigen. Skeptik má v tomto případě pravdu, jelikož jsem při svém popisu V-D-J rekombinace pro lepší pochopení celého procesu neuvedl důležitý detail. V místě, kde se segmenty spojí, totiž pracuje enzym zvaný terminální deoxyribonukleotidyltranferáza (TdT). Ten do místa spojení vloží náhodný řetězec nukleotidů. Výsledkem může být například vznik STOP-kodónu, který způsobí, že je translace receptoru ukončena předčasně. Nebo se třeba posune čtecí rámec, takže STOP-kodón vznikne někdy později. Ale také může vzniknout zcela unikátní sekvence vazebného místa receptoru. Takto obdobně vznikají i v evoluci nové proteiny vlivem náhodných přestaveb částí genomu, způsobených chybnými opravami poškození DNA. Mohou tak být například propojeny úseky chromozómů, které spolu původně nesouvisely. Není potřeba hromadit bodové záměny, inzerce či delece. Výsledkem přestaveb jsou proteiny s úplně novou aminokyselinovou sekvencí. Výpočet, kolika kroky lze dospět k příslušné aminokyselinové sekvenci, jímž se občas vytasí náboženští blouznivci, když dokazují, jak nepravděpodobné to je, tedy nemusí dávat žádný smysl.

Po rekombinaci je třeba zrající T- a B-lymfocyty roztřídit (selektovat). Občas se tomu přezdívá „drsná mateřská školka“, protože těchto buněčných „dětiček“ nepřežije až 95 % (to snad nebylo ani ve starověké Spartě). Vzhledem k tomu, že jsou takovýchto prekurzorů produkovány miliardy denně, znamená i 5 % přeživších, že jich zůstane opravdu velmi mnoho. Navíc si zachovají schopnost dále se pomnožovat, dostanou-li k tomu signál od ostatních buněk (čili další nadprodukce potomstva).

Během selekce jsou buňky v těsném kontaktu s pomocnými buňkami v kostní dřeni (v případě B-lymfocytů) či brzlíku (u T-lymfocytů; brzlík je odborně thymus, odtud to „T“, zatímco „B“ je orgán, v němž zrají B-lymfocyty, nicméně jenom u ptáků – Fabriciova burza). Nejdříve je třeba během selekce ověřit, zda je po všech rekombinacích produkován funkční receptor. Nezralé T- a B-lymfocyty mají v této době značnou převahu signálů, které vyvolávají regulovanou buněčnou smrt. Pokud nedostanou silný signál k přežití, nepřežijí. Říká se tomu „smrt z nezájmu“ (death by neglect), protože tento signál dostanou pouze buňky, které na svém povrchu „vystaví“ funkční receptor. Ostatní mají „smůlu“.

První fáze selekce tedy odstraní všechny buňky, u nichž náhodnými přestavbami vznikly předčasné STOP-kodóny či má nově vzniklý receptor natolik narušené prostorové uspořádání, že není na buněčném povrchu „vystaven“ správně. Přiznejme si, že již v první fázi selekce to nepřežije většina buněk. Tím dávám za pravdu náboženským blouznivcům, že velká část mutací je škodlivá a své nositele v selekci znevýhodňuje. Avšak díky nadprodukci potomstva pořád zbývají ti jedinci, kteří nesou prospěšné mutace. Zde, v této fázi selekce nezralých T- a B-lymfocytů, to znamená, že mají na svém povrchu receptor, který je i navzdory „brutálním“ náhodným mutacím stále funkční. Teoreticky by tedy mohl něco vázat – třeba něco, co pochází z patogenního organismu během infekce.

I tady však musí nastoupit další fáze selekce, protože to „něco“, co by receptor příslušné buňky mohl vázat, může být i tělu vlastní struktura. To by potom vedlo k vážným autoimunitním chorobám. Buňky, jejichž antigenně specifické receptory jsou schopny vázat cokoli tělu vlastního, je tedy potřeba také odstraňovat. Děje se to tak, že pomocné buňky, s nimiž jsou nezralé T- a B-lymfocyty v kontaktu, slabě aktivují všechny své geny, které kódují proteiny (protože všechny buňky našeho organismu mají společný genom), vzniklé proteiny pak naštípají na malé kousky (peptidy), a ty pak vystavují na svém povrchu. Pokud je nějaký T- či B-lymfocyt dokáže svým antigenně specifickým receptorem vázat, znamená to pro něj takřka vždy konečný ortel – kaskádu signálů, jež vyvolají regulovanou buněčnou smrt. Tomuto procesu se říká negativní selekce. Přežije pouze malá část T-lymfocytů, které se přemění na regulační buňky. Jejich následnou funkcí je tlumit ty T- a B-lymfocyty, které negativní selekci uniknou (žádný buněčný pochod není zcela dokonalý).

Očividně je to tedy výborně nastavený proces zahrnující mnohastupňovou kontrolu. Problém však je, že se regulační T-lymfocyty účastní také imunitních reakcí proti nádoru. Některými nádory jsou regulační T-lymfocyty vhodně aktivovány, popřípadě se v ně mění i ty T-lymfocyty, které by nádor dokázaly ničit (to se nádorové buňky „naučí“ vyvolat, neboť mají k dispozici stejný genom jako regulační buňky imunitního systému). Tím je imunitní reakce proti nádoru utlumena. Není v tom žádná magie (viz „mysli pozitivně a už nebudeš mít nádor“). Prostě to některé zvláště obtížně zvládnutelné nádory dokáží a imunitní systém poté svádí takřka marný boj, neboť musí překonat obranu tlumivých T-lymfocytů.

Ale to jsem odbočil. Někdy se určitě více rozepíši i o karcinogenezi, ale je to poměrně komplikované téma, které si nechávám na později (až dokončím regulovanou buněčnou smrt a další témata, jež mám v plánu – myslím, že to bude potřeba pro pochopení takto náročné problematiky).

V procesu zrání T- a B-lymfocytů jsme se nyní dostali k tomu, že už přežily takřka pouze buňky, které na svém povrchu mají funkční antigenně specifický receptor, který však neváže nic tělu vlastního. A teď tedy mohou býti „dychtivé dětičky“ vypuštěny do těla – nyní se jim říká naivní T- a B-lymfocyty („naivní“ proto, že se ještě nikdy nesetkaly s antigenem, který by dokázaly vázat svým receptorem).

Tyto mladé buňky následně kolují krevním řečištěm i lymfatickými cévami a nejraději se usazují v lymfatické tkáni, zejména v uzlinách. Tam čekají, až se konečně setkají s tím antigenem, pro nějž byly „stvořeny“ (zcela náhodnými přestavbami genomových úseků, které kódují vazebné místo pro antigen).

Probíhá to následovně: do lymfatické tkáně postupně „přicházejí“ dendritické buňky. Ty se vyskytují v různých místech organismu, ale nejvíce jich je poblíž povrchu sliznic (protože ty představují místo kontaktu s vnějším prostředím). Tam pohlcují všechno, u čeho „usoudí“, že za pohlcení stojí. Když toho mají dostatek, dolezou do nejbližší lymfatické (mízní) uzliny, rozprostřou velmi doširoka své výběžky (proto se jim říká dendritické buňky – těmi výběžky trochu připomínají větvení stromu) a na svém povrchu začnou ukazovat úlomky toho, co pohltily (bývají proto označovány jako profesionální buňky prezentující antigen – znovu odkazuji ke svému článku o adaptivním imunitním systému, ať se nemusím opakovat).

Dendritické buňky slouží coby taková vývěska. K ní poté přicházejí jednotlivé T-lymfocyty a zkoumají, zda jejich antigenně specifický receptor nenaváže něco, co dendritické buňky vystavují. Tyto buňky se občas mohly splést a pohltit něco tělu vlastního, ale po všech těch selekcích už chybějí ty T-lymfocyty, které by to rozpoznaly (ty tlumivé nelezou do mízních uzlin, stahují se spíše do místa imunitní reakce, které rozpoznají díky „naváděcím“ molekulám, jež jsou v tomto místě produkovány).

Pokud T-lymfocyt něco „vystaveného“ na dendritické buňce rozpozná, aktivuje se a začne se množit (proto lymfatická uzlina značně naroste). Tomuto procesu se říká pozitivní selekce, protože se pomnožují pouze ty T-lymfocyty, které rozpoznaly antigen. Poté záleží, k jaké třídě T-lymfocyt patří. Některé typy jsou schopny pomocí svých antigenně specifických receptorů vyhledávat „podezřelé“ buňky a poskytovat jim signály k tomu, aby podstoupily regulovanou buněčnou smrt (tzv. cytotoxické T-lymfocyty), zatímco jiné pomáhají dalším složkám imunitního systému (pomocné T-lymfocyty). Jedna třída pomocných T-lymfocytů je nezbytná i pro funkci B-lymfocytů (bohužel je to zrovna ta třída, kterou likviduje virus HIV, což má nakonec fatální následky pro adaptivní imunitní systém – syndrom získaného selhání imunity neboli AIDS).

Naivní B-lymfocyty nejprve také fungují jako profesionální buňky prezentující antigen. Pokud pomocí svého antigenně specifického receptoru něco naváží, pohltí to a poté úlomky „vystaví“ na svém povrchu. Jestliže se jedná o něco v místě infekce, je vysoce pravděpodobné, že se mezitím stačily, za pomoci dendritických buněk, pomnožit a aktivovat příslušné T-lymfocyty, které to také umějí rozpoznávat. B-lymfocyt tedy čeká, až se s takovýmto pomocným T-lymfocytem setká. V případě, že T-lymfocyt pomocí svého antigenně specifického receptoru naváže to, co B-lymfocyt „vystavuje“ na svém povrchu, poskytne B-lymfocytu aktivační signály. Pro B-lymfocyt to znamená signál k prudkému množení. Také tento proces se nazývá pozitivní selekce.

Aktivované B-lymfocyty začnou produkovat i rozpustné formy svého antigenně specifického receptoru (protilátky), ale ty zpočátku váží antigen jenom velmi slabě. Nachází-li se třeba na povrchu baktérie, občas to ani nestačí k tomu, aby ji navázané protilátky dostatečně označily k pohlcení fagocytujícími buňkami, a pokud se to přeci jenom podaří, je to pohlcení jenom málo účinné. To má ovšem docela jednoduché vysvětlení: ty protilátky vznikly naprosto náhodnými přestavbami genomu. Je jen málo pravděpodobné, že by dokázaly něco vázat s vysokou efektivitou. Tady bych asi přiznal dílčí bod pro náboženské blouznivce, kteří prohlašují, že náhodné mutace nemohou vytvořit nic smysluplného. Až do této chvíle můžeme vidět, že sice vytvořily, ale váže se to jenom slabě a není to moc účinné. Také proto je prvních pár dní infekce většinou nejhorších.

Proces „vylepšování“ antigenně specifického receptoru B-lymfocytů ovšem tímto nekončí (jak už jsem se zmínil výše). Pomnožující se B-lymfocyty totiž vazebné místo pro antigen dále mutují. Využívají k tomu náhodné chemické modifikace nukleotidů kódujících vazebné místo pro antigen. Tím opět řízeně poškodí DNA. Buněčné mechanismy oprav pak znovu udělají chyby a výsledkem jsou zcela náhodné mutace v místě pro vazbu antigenu. Zároveň se takovéto B-lymfocyty velmi rychle množí (buď v mízní uzlině, což znamená další růst uzliny, nebo přímo v místě infekce) – čili dochází k další nadprodukci potomstva, které je zároveň velmi variabilní, a tato variabilita je dědičná (došlo k nevratným změnám v genomu).

K darwinismu už zde chybí už jenom selekce. A k té také dochází, jelikož B-lymfocyty v tomto procesu, nazvaném afinitní maturace („zrání vazebných schopností“), stále pohlcují to, co dokáží svým antigenně specifickým receptorem navázat. Pokud mutace způsobí, že je antigenně specifický receptor nefunkční či něco váže slaběji, znamená to, že taková buňka či její klon (potomstvo) už na svém povrchu nic moc nevystaví. Takže ani nedostane potřebné signály od pomocných T-lymfocytů, množí se pomalu, popřípadě se nemnoží vůbec a prodělá regulovanou buněčnou smrt, jelikož jí chybějí signály k přežití. Ale ten malý podíl B-lymfocytů, který vlivem mutací dokáže vázat antigen mnohem účinněji, také na svém povrchu „vystaví“ daleko více úlomků toho, co pohltily. To pak znamená, že dostanou mnohem silnější signál k pomnožování a k dalším mutacím. Jejich potomstvo postupně převládá a nejsilnější signál k množení stále dostávají ty B-lymfocyty, které dokáží nejsilněji vázat antigen. A ty nakonec zcela převládnou. Již po několika dnech tedy vznikne antigenně specifický receptor B-lymfocytů, který velmi silně váže ten antigen, s nímž se tělo právě setkalo. To znamená mnohem účinnější eliminaci cizorodých struktur, na něž se účinně váží protilátky (rozpustné antigenně specifické receptory B-lymfocytů).

Po skončení akutní fáze imunitní reakce se naprostá většina aktivovaných T- i B-lymfocytů sama zabije, jelikož už nejsou potřeba (opět regulovaná buněčná smrt). Malá část z nich se ale stane paměťovými buňkami. Až se příště setkají se stejným antigenem, už nepodstoupí afinitní maturaci, neboť ho velmi dobře rozpoznají a začnou se množit okamžitě (není zde několikadenní prodleva jako při prvním setkání s antigenem). Vyvolání imunitní reakce, která neohrožuje život, a následného vzniku paměťových buněk je i podstatou očkování.

Nicméně i proti očkování brojí různí šarlatáni, často ověnčeni akademickými tituly. Ti nejodvážnější dokonce lžou, že očkování nemá žádný účinek. Každý obor má své šarlatány, kteří zneužívají svého postavení k šíření osobních názorů, nikterak nepodložených vědeckými výzkumy. Takovéto šarlatány mají i ostatní obory biologie, a mezi tyto šarlatány počítám i popírače evoluce.

Zde totiž můžeme dobře vidět, jak prostým hromaděním mutací (dědičných změn genomu) a následnou selekcí nadprodukovaného potomstva může vzniknout úplně nová vlastnost – vazba antigenu. Ta poté může býti dalšími mutacemi, nadprodukcí potomstva i selekcí dále zesílena. Na molekulární úrovni výběr funguje naprosto spolehlivě. Proč by tedy nemohl fungovat na makro-úrovni?

Pravda, náboženští blouznivci zase začnou něco o tom, že je to jiný proces, neboť je až moc regulován, popřípadě že se jedná jenom o malou část proteinu, takže se to nedá vztáhnout na zbytek, či dokonce ostatní proteiny. Podle mého názoru se to dá vztáhnout velmi dobře. Zrání antigenně specifického receptoru B-lymfocytů je jenom usměrněná darwinistická evoluce. Díky tomuto usměrnění trvá pouze několik dní. Proto ji můžeme pozorovat. Evoluce na úrovni populací či druhů probíhá obdobně, ale trvá déle v závislosti na generační době příslušného taxonu. U jednobuněčných organismů, zvláště u baktérií, je skoro stejně rychlá jako u buněk imunitního systému, u slonů je pochopitelně mnohem pomalejší. Je to však stále tentýž proces.