Regulovaná buněčná smrt II. - Apoptóza

Další část série článků týkajících se regulované buněčné smrti je věnována apoptóze, komplexnímu ději sloužícímu k odstraňování nepotřebných či nebezpečných buněk a recyklaci jejich materiálu.

Apoptóza je doposud nejlépe prozkoumanou formou regulované buněčné smrti, rád bych na ní tedy demonstroval některé z obecnějších principů buněčné signalizace. Jak bylo uvedeno v minulém článku, buněčná smrt byla původně rozlišována na regulovanou apoptózu a neregulovanou, zcela neřízenou nekrózu. Další výzkum však ukázal, že se mohou uplatňovat i jiné formy regulované buněčné smrti, například při některých patologických pochodech, kdy je výhodné vyvolat imunitní reakci. O těchto dalších formách regulované buněčné smrti bude řeč příště.

Apoptóza se vyznačuje tím, že při ní nedochází k vylití buněčného obsahu, a nepodporuje proto zánětlivou odpověď. V průběhu apoptózy se nejprve kondenzuje chromatin (komplex DNA a s ní asociovaných proteinů), poté je DNA masivně štěpena, mění se struktura cytoskeletu a buněčné membrány a buňka se nakonec rozpadne na drobné váčky (apoptotická tělíska), které jsou pohlceny a rozloženy fagocytujícími buňkami (například makrofágy). Důležitá je pro odstraňování nepotřebných i potencionálně nebezpečných buněk. Pro mnohobuněčný organismus je obecně bezpečnější a také snadnější tyto buňky odstranit, než se je pokoušet opravovat či je převádět na jinou funkci. Materiál z odstraněných buněk je potom recyklován. Takto zanikají třeba některé tkáně během zárodečného vývinu (například blanka mezi prsty), ale také pomnožené bílé krvinky po potlačení infekce. Vysoká aktivita imunitního systému může organismus poškozovat, a proto většina aktivovaných bílých krvinek po nějaké době podstoupí apoptózu. Jenom malý podíl z nich se stává paměťovými buňkami, připravenými pro případ, že by se tělo setkalo se stejným patogenem (podrobněji je to popsáno zde). Apoptózu ovšem prodělají také buňky, které imunitní systém vyhodnotí coby potencionální hrozbu – zejména takové, jež na svém povrchu vystavují zbytky cizích proteinů, které mohou pocházet od virové infekce či od nádorových mutací. A apoptotická signalizace se může spustit rovněž u buněk, které dostávají příliš mnoho signálů k pomnožování. Apoptóza i jiné formy regulované buněčné smrti tedy představují důležitou ochranu před nádorovým bujením.

Vzhledem k tomu, že se jedná o nevratný proces, na jehož konci je buňka zcela zničena, musí být apoptóza velmi přísně regulována. K patologickým stavům může vést jak její potlačení, tak i její nadměrné spouštění. Také u apoptotické signalizace tedy můžeme vidět obdobné schéma, jaké bylo popsáno zde, avšak regulace je mnohem komplexnější. Není to jako u našich spotřebičů, kde navolíme program, stiskneme tlačítko „spustit“ a program běží. Všechny naše buňky mají totiž stále aktivní jak signály, které mohou vyvolat apoptózu, tak i signály ji inhibující. Teprve jejich vzájemný poměr určí, zda buňka přežije, nebo zda podstoupí regulovanou buněčnou smrt. Různé buněčné pochody mohou aktivovat různé pro- nebo protiapoptotické signály a náchylnost k regulované buněčné smrti je ovlivňována i celkovým stavem buňky. Pokud je v ní například přítomno větší množství stresových signálů, značících nějaké poškození, je buňka k proapoptotické signalizaci mnohem citlivější. Také třeba u nezralých T- a B-lymfocytů po určitou část jejich vývoje převažují proapoptotické signály. Jestliže takováto buňka nedostane silný signál pro přežití ze svého nově vzniklého antigenně specifického receptoru, značí to, že je vadná, a rovnou podstoupí apoptózu (blíže je zrání lymfocytů popsáno zde).

Jak již bylo uvedeno minule, signály, jež spouštějí apoptózu, jsou obecně rozlišovány na vnější a vnitřní. Leckdy však může jít o kombinaci obojího (viz výše – silnější buněčný stres, tj. vnitřní signál, zvýší citlivost k apoptóze vyvolané aktivací povrchových proapoptotických receptorů, neboli ke vnějšímu signálu). Mezi vnější spouštěče apoptózy patří třeba nedostatek signálů pro množení u těch typů buněk, které se pomnožovat mají. Většina našich buněk se totiž nemnoží sama od sebe, nýbrž vyčkávají na to, až k tomu dostanou povel. Některé tento povel nedostanou téměř nikdy (zejména plně diferencované buňky našich tkání, např. nervové buňky), jiné se dělí neustále, aby doplňovaly rychle se opotřebovávající tkáně (zejména tkáňové prekurzory například v kůži, stěně střev či třeba kmenové buňky kostní dřeně). Pokud buňky, jež se mají dělit, signály k dělení nedostávají, samy podstupují apoptózu, protože zjevně nejsou potřeba. Podobně hynou i některé buňky, které ztratí signály zakotvení, podle nichž jsou schopny poznat, že jsou ve správné tkáni (každá tkáň je má specifické právě pro ty buňky, které se v ní mají nacházet). Pokud tyto signály chybějí, pravděpodobně to znamená, že se buňka dostala někam, kde nemá co dělat. Proto raději podstoupí regulovanou buněčnou smrt. Tato tzv. anoikis brání tomu, aby se ve tkáních vyskytovaly buňky z jiných tkání, což by narušovalo jejich funkci, a je i určitou bariérou proti růstu nádorových metastáz.

Velmi důležitou skupinou senzorů vnějších apoptotických signálů jsou tzv. receptory smrti (opravdu se jim tak říká i v anglické terminologii – death receptors). Ty se vyskytují prakticky na všech buňkách a aktivovat je lze vazbou speciálních ligandů (ligand je to, co se váže na receptor), zejména Fas-ligandu a ligandu TRAIL, přítomných zejména na cytotoxických T-lymfocytech a NK-buňkách. Pokud tyto buňky imunitního systému rozpoznají některou buňku jakožto podezřelou, podráždí pomocí svých ligandů její receptory smrti, a tím ji přimějí podstoupit apoptózu (podrobněji popsáno zde). Aktivované cytotoxické lymfocyty ovšem tyto ligandy posléze ukazují i samy sobě, čímž jsou po uplynutí imunitní reakce postupně odstraňovány (viz výše). Cytotoxické buňky imunitního systému mají i další zbraně, jimiž mohou podpořit apoptózu, což se hodí u těch „podezřelých“ buněk, které (třeba vlivem nádorových mutací) odmítají reagovat na podráždění receptorů smrti. Cytotoxické lymfocyty do nich proto přímo vpraví enzymy, jež vyvolají apoptózu.

Vnitřním spouštěčem apoptotické signalizace může být jakékoli poškození buňky, například nadměrný výskyt chybně poskládaných proteinů, vysoká míra oxidačního stresu, poškozená DNA, narušený systém vnitřních membrán, chyby při dělení buňky, ale také vysoká aktivace drah podporujících dělení. Buňka se všechny zaznamenané poruchy nejdříve pokouší opravit, nicméně pokud signály poškození přetrvávají, mohou spustit apoptózu nebo jiné formy regulované buněčné smrti.

Po zaznamenání signálu je dalším krokem v buněčné signalizaci jeho integrace a znásobení. Klíčovou roli u apoptózy při tom hrají mitochondrie, buněčné „elektrárny“, v nichž probíhá buněčné dýchání za produkce univerzální energetické zásobárny ATP a CO2 a vody coby odpadu. Během apoptotické signalizace je mitochondriální membrána narušována, vznikají v ní póry, jimiž unikají různé molekuly. Dochází tím ke „zkratování“ mitochondriálního membránového potenciálu, nezbytného pro tvorbu ATP, k uvolnění značného množství reaktivních forem kyslíku („volných radikálů“), jež dále poškozují buňku a přispívají k zesílení proapoptotických signálů, a také k vypouštění proteinů, které buď inhibují inhibitory apoptózy, nebo apoptotickou signalizaci přímo podporují.

Důležitou úlohu při regulaci tvorby pórů hrají proteiny z rodiny Bcl-2. Zkratka Bcl-2 znamená „B-cell lymphoma 2“ a naznačuje, že byl tento protein poprvé popsán u B-buněčného lymfomu. Vzhledem k tomu, že protein Bcl-2 patří k inhibitorům apoptózy, jeho nadprodukce nádorové buňky chrání. Proces karcinogeneze bývá spojen s rozsáhlými poškozeními DNA i s dalšími formami buněčného stresu, a pokud je tedy apoptotická signalizace potlačena, může buňka přežít. Stane se též odolnou vůči vnějším apoptotickým signálům. Postupně se ukázalo, že je protein Bcl-2 součástí větší proteinové rodiny. Všichni členové této rodiny sdílejí protein-proteinové interakční motivy zvané Bcl-2 homology domain (BH) a liší se pouze v jejich počtu (mohou mít 1 až 4 tyto domény). Proteinová rodina Bcl-2 zahrnuje tři velké skupiny proteinů. Jednak jsou to proteiny, které přímo napomáhají vzniku pórů v mitochondriální membráně (zejména Bax a Bak). Dále sem patří proteiny, které se na ně pomocí svých BH-domén váží, a tím je inhibují (mezi tyto inhibitory patří i Bcl-2). Právě regulací jejich množství a aktivity si buňka nastavuje míru své citlivosti k apoptotickým signálům. A nakonec existuje ještě velká skupina proteinů zvaných pouze-BH3 (BH3-only proteins), které obsahují pouze doménu BH3 a buď inhibují inhibitory apoptózy z rodiny Bcl-2, nebo proteinům Bax a Bak napomáhají k tvorbě pórů. Právě tyto pouze-BH3-proteiny představují důležité senzory, které vnější i vnitřní apoptotické dráhy integrují na mitochondriích. Například protein Bid je štěpen, a tím aktivován signály z receptorů smrti, zatímco třeba exprese proteinů Noxa a Puma je aktivována transkripčním faktorem p53, klíčovým senzorem poškození DNA i jiných forem buněčného stresu, včetně nadměrných signálů podporujících buněčné dělení.

Po zaznamenání a znásobení apoptotického signálu jsou jeho důležitými vykonavateli speciální enzymy zvané kaspázy, které štěpí další proteiny (jedná se tedy o typ enzymů zvaných proteázy). Tím je mohou aktivovat, nebo naopak inhibovat. Pokud dojde k aktivaci kaspáz, buňka už nemá příliš mnoho možností, jak apoptózu zvrátit. Rozlišují se dvě skupiny kaspáz, jednak iniciační kaspázy, které jsou součástí zaznamenání a amplifikace signálu, a dále výkonné (efektorové) kaspázy, sloužící k provedení apoptózy. Všechny kaspázy jsou produkovány jakožto neaktivní proenzymy, které jsou aktivovány až naštěpením (podobně jako proteázy naší trávicí soustavy – např. pepsin štěpením pepsinogenu, trypsin z trypsinogenu, aj.). Iniciační kaspázy také obsahují dlouhé úseky zvané prodomény, jež musejí být odštěpeny. Součástí těchto prodomén jsou protein-proteinové interakční motivy zvané výkonné domény smrti (death effector domains, DED), jimiž se váží do různých proteinových komplexů, kde dochází k jejich aktivaci. Takto se například kaspáza-8 váže do komplexu DISC (death inducing signalling complex, „smrticí signální komplex“). Po své aktivaci poté štěpí výkonné kaspázy-3, a apoptóza tím může začít. Takto přímá cesta by však mohla být pro buňky nebezpečná, a proto většinou samotná aktivace kaspázy-8 nestačí (dostatečná je například u lymfocytů po odeznění imunitní reakce) a signál je třeba dále zesílit přes mitochondrie. K tomu slouží štěpení a aktivace pouze-BH3-proteinu Bid (viz výše). Protože jsou zároveň aktivní protiapoptotické proteiny z rodiny Bcl-2, musí být signál dostatečně silný, aby jejich působení překonal. Jakmile dojde k narušení mitochondriální membrány, uvolní se kromě jiného protein cytochrom-c, jehož přítomnost v cytoplazmě způsobí tvorbu proteinového komplexu zvaného apoptozóm. V něm je aktivována iniciační kaspáza-9, která dále přispívá k aktivaci výkonné kaspázy-3.

Jelikož je aktivace kaspáz pro zdárný průběh apoptózy klíčová, buňka také produkuje proteiny, jež tomu brání (třeba c-FLIP či proteiny z rodiny IAP – inhibitors of apoptotic proteins). Tím samy sebe chrání před náhodnou aktivací kaspáz. Produkcí těchto proteinů mohou také dále regulovat svou citlivost k apoptotické signalizaci. Tyto inhibitory apoptózy jsou inhibovány proteiny, jež se uvolňují z mitochondrií po narušení jejich membrány. Aktivace kaspáz tedy může započít.

Jak je tedy vidět, ke spuštění apoptózy je nutno integrovat větší množství signálů. Obdobně to ale probíhá také u dalších signálních drah. K jejich dokonalému poznání máme ještě daleko, i proto zatím není možné vytvořit umělou buňku. Avšak i to, co víme, stačí k uvědomění si, že se buňky značně liší od kteréhokoli lidmi vytvořeného stroje, a jakákoli analogie s nimi tudíž pokulhává. Buňky jsou zkrátka živé.

Výše popsaná apoptotická signalizace je shrnuta na následujícím obrázku. Protože je převzat z odborného článku, vyskytují se v něm i další zkratky, jež nebyly v textu zmíněny, zejména názvy dalších protein-proteinových interakčních motivů, jež se uplatňují při vytváření proapoptotických komplexů. I tento obrázek je ovšem značně zjednodušený, dnešní poznání dospělo mnohem dále.

Pro pořádek je ještě vhodné uvést, že existuje také záloha, jestliže by hlavní dráha apoptotické signalizace selhala, což se může stát kupříkladu u silně změněných nádorových buněk. V případě trvalé inhibice kaspáz může proběhnout tzv. buněčná smrt nezávislá na kaspázách, která může mít jak podobu apoptózy, tak i dalších forem buněčné smrti. Zpravidla i dosti mutované nádorové buňky mívají aspoň některé dráhy buněčné smrti zachované. Je třeba pouze najít cestu, jak je aktivovat. Dalším formám buněčné smrti bude věnován následující článek.